FRET（熒光共振能量轉移）

熒光共振能量轉移 (FRET) 是一種在分子尺度上表征距離相關相互作用的強大技術。它是為數(shù)不多的能夠測量體內和體外分子間和分子內距離相互作用的工具之一. FRET 涉及通過其吸收光譜內的入射光激發(fā)供體熒光團。這種輻射吸收將供體熒光團提升到更高能量的激發(fā)態(tài)，該激發(fā)態(tài)通常會以特征發(fā)射光譜輻射衰減（返回基態(tài)）。如果另一個熒光團分子（受體）存在于供體附近，其能量狀態(tài)的特征是吸收光譜與供體的發(fā)射光譜重疊，則供體和受體之間存在非輻射能量轉移的可能性。圖1顯示了青色熒光蛋白（CFP）發(fā)射光譜和黃色熒光蛋白（YFP）吸收光譜的重疊；這對支持強大的 FRET 相互作用。

圖 1：CFP（供體）和 YFP（受體）吸收和發(fā)射光譜。

CFP 發(fā)射和 YFP 吸收（陰影區(qū)域）之間的重疊導致有效的 FRET 相互作用。

***能量轉移由供體和受體熒光團分子之間的偶極-偶極相互作用（范德華力）介導，其變化為兩個分子之間距離的倒數(shù) 6 次方。從供體到受體的能量轉移速率大約為 k_F     k_F~k_D(r₀/r)⁶

其中 k_D是供體熒光團的輻射衰減率，或在沒有受體熒光團的情況下熒光發(fā)射壽命的倒數(shù)（通常為 1 – 50 ns），r 是兩個分子之間的距離， r₀
是“"Förster距離”，表征能量傳輸?shù)?50% 效率點。FRET 適用于測量 FRET is suited to measuring changes in Förster 距離數(shù)量級的距離變化，通常為 20 到 90 Å.

在能量從供體轉移到受體后，受體熒光團被激發(fā)到其熒光發(fā)射狀態(tài)。因為從受體觀察到的熒光發(fā)射速率受從供體到受體的能量轉移的速率限制，所以 FRET 發(fā)射的定量測量可以使用上述方程提供距離的推斷測量。準確的 FRET 測定通常涉及比較有和沒有受體存在的樣品中的供體和供體-受體熒光發(fā)射強度。比率測量是必要的，因為如圖 1 所示，供體和受體發(fā)射光譜之間通常存在重疊，因此，很難通過單次測量準確確定使用受體發(fā)射濾光片測量的熒光的哪一部分僅來自受體。熒光壽命測量為能量轉移率提供更直接的結果，不易受濃度變化的影響，并且可以使用時域或相位調制壽命測量技術進行。 

FRET 應用通常以非常低的分子熒光團濃度為特征。使用精心優(yōu)化的濾光片對于檢測微弱的熒光發(fā)射信號至關重要。Semrock BrightLine® 熒光濾光片提供盡可能高的透射率，以最/大化 FRET 發(fā)射信號，以及精心優(yōu)化的透射通帶深度阻擋，以實現(xiàn)最大可能的信號背景比（最高對比度）。

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圖 2：用于定量測量供體發(fā)射的 CFP 激發(fā)片、二向色和發(fā)射片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）

圖 3：帶有 YFP 發(fā)射濾光片（來自 BrightLine FRET-CFP/YFP-A 濾光片組）的CFP 激發(fā)片和二向色濾光片，用于受體發(fā)射的定量測量。

可以使用兩個不同的濾光片組（立方體）依次進行這兩個測量，其中每個濾光片組（立方體）具有相同的激發(fā)濾光片和二向色濾光片，但發(fā)射濾光片不同。不推薦這種方法，因為濾光片立方體之間的像素偏移會使測量結果失真，并且更換濾光片立方體需要相對較長的時間并導致樣品振動，從而影響感興趣分子之間的距離。相反，建議使用更快速、低振動的濾光片切換或真正同時檢測供體和受體發(fā)射，尤其是在對移動的活細胞樣本執(zhí)行 FRET 時。對于那些選擇使用兩個單獨的濾光片立方體的人來說，選擇旨在
消除像素偏移的濾光片組很重要 以獲得最準確的測量值。

使用發(fā)射濾光輪可以實現(xiàn)快速、低振動的濾光片更換。這是用于寬視場 FRET 測量的最常見的顯微鏡配置。一些研究人員更喜歡使用雙濾光片轉輪系統(tǒng)（一個用于激發(fā)片，一個用于發(fā)射片）的靈活性，盡管這種系統(tǒng)在軟件控制方面更昂貴且更復雜。對于雙濾光片轉輪系統(tǒng)，最/好/的濾光片組選擇是 Sedat 多波段組。最后，還可以使用兩個攝像頭同時檢測供體和受體發(fā)射通道。一些制造商為此應用制造顯微鏡附件。除了標準的 FRET 濾光片組外，還需要一個額外的二向色分束鏡來分隔附件中的兩個發(fā)射路徑。

熒光濾光片簡介

一個分子吸收其吸收譜帶波長范圍（即吸收光譜）內的光，然后幾乎瞬間發(fā)出較長的、位于其發(fā)射譜帶波長范圍（即發(fā)射光譜）內的光，此時，就會發(fā)生光學熒光。為了達到分析的目的，強的熒光分子，亦被稱為熒光團、熒光染料，專門用于連接到生物分子或其他感興趣的目標，用于鑒定、定量、甚至實時觀察物質的生物和化學活性。熒光染料因為具有*的靈敏度、高特異性和簡單性，被廣泛應用于生物技術和分析檢測中。大多數(shù)熒光儀器，包括熒光顯微鏡，都是基于光學濾光片。

一個典型的系統(tǒng)有三個基本的濾光片組成：激發(fā)濾光片（或吸收濾光片），二向色鏡分束鏡（或二向分色鏡）和發(fā)射濾光片（或阻擋濾光片）。激發(fā)濾光片通常是一個帶通濾光片，它只透過熒光染料的吸收波長，從而最大限度地減少熒光的其他來源的激發(fā)光和阻擋熒光發(fā)射帶內的激發(fā)光。二向色鏡分束鏡是一種邊緣濾光片，用于斜角入射 （通常是 45 °），以有效地反射激發(fā)波段的光和透射發(fā)射波段的光。Semrock 發(fā)射濾光片通常是一個帶通濾光片，僅透過熒光染料的發(fā)射波長，并阻擋這個波段之外的所有不需要的光 - 尤其是激發(fā)光。通過濾光片阻擋不需要的激發(fā)能量（包括紫外和紅外）或樣品和系統(tǒng)的自發(fā)熒光，就可以得到具有黑暗背景的熒光圖像。

我們可以通過選擇適當?shù)墓鈱W濾光片，組成一個濾光片組，用于觀察熒光或者對熒光進行成像，這樣就可以達到使一個給定的熒光染料可視化的目的。因為不同熒光染料的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜不同，濾光片組需要優(yōu)化，才可以用于不同熒光染料的同時成像。在不同的實驗條件下使用同一個熒光染料時，濾光片組也需要優(yōu)化。